Hippuraattitesti campylobacter jejunin tunnistuksessa

Hippuraattitestiä käytetään Campylobacter jejunin tunnistuksessa. 

Hippuraattitestissä C. jejunin hipO-geenin koodittama hippurikaasi-entsyymi pilkkoo hippuraatin bentsoehapoksi ja glysiiniksi. Lisättävän ninhydriinin aiheuttamassa värireaktiossa syntyy tummansininen lopputuote. Aina C. jejuni -kanta ei kuitenkaan laboratorio-oloissa tuota toimivaa hippurikaasientsyymiä.

THL:n Asiantuntijamikrobiologiayksikössä hippuraattitesti tehdään Roscon hippuraattikiekoilla (DiatabsTM, Rosco Diagnostica A/S, Tanska). 

Testin kulku

• Tutkittavia kantoja ja kontrollikantoja kasvatetaan 40–48 h verimaljoilla mikroaerobisessa ympäristössä. 
• Bakteeriviljelmästä tehdään suspensio 0,9 % NaCl:iin. Suspension sameuden pitäisi olla McFarland 6‒10. 
• Suspensio tehdään wasserman-putkeen 2ml:aan NaCl:ia ja sameus mitataan fotometrillä (GENE-TRAK®, GENE-TRAK Systems, Hopkinton, USA) aallonpituudella 450nm. 
• Lisätään bakteerimassaa tai laimennetaan, kunnes fotometrin lukema on 0,8–1,4.
• Siirretään 250μl suspensiota uuteen putkeen ja lisätään putkeen hippuraattikiekko.
• Inkuboidaan 35‒37°C:ssa 4 tuntia. 
• Lisätään 5 tippaa ninhydriinreagenssia/putki ja inkuboidaan 10 min 35‒37°C:ssa.

Positiivinen tulos on tummansininen/purppura ja negatiivinen tulos väritön/kellertävä. 

Testin tulos olisi hyvä lukea heti 10 minuuttia inkubaation jälkeen, vaikka näitä sameusrajoja käytettäessä tulos pysyy muuttumattomana vähintään 30 minuuttia.

Testin onnistumisen edellytykset

Tärkeitä tekijöitä testin onnistumisessa on kasvatus verimaljalla ja riittävän suuren solumäärän käyttö. 

Kuitenkin jos testissä käytetään liian vahvaa suspensiota, myös C. colin hippuraattitestin tulos alkaa näyttää positiiviselta. 

Kuvassa hippuraattitestin tulos on havainnollistettu bakteerisuspension vahvuuden vaikutusta hippuraattitestin tulokseen. Testissä on käytetty Roscon hippuraattikiekkoja ja solumäärä on 250μl:n NaCl:ia liuotettava määrä. Kun solususpensio on sameudeltaan vähintään McFarland 6 ja enintään McFarland 10, positiiviset tulokset havaitaan eikä vääriä positiivisia esiinny.
Hippuraattitestin tulos (pdf 47 kt)

Kun testissä käytetään sopivaa solumäärää ja toimivia kontrollikantoja voidaan hippuraattipositiivinen kampylobakteerikanta luotettavasti nimetä C. jejuniksi. 

Hippuraattinegatiivisen kannan laji täytyy määrittää muilla biokemiallisilla tai molekyyligeneettisillä menetelmillä (Nakari et al. 2008).

Viitteet

Nakari, U. M., A. Puhakka, and A. Siitonen 2008. Correct identification and discrimination between Campylobacter jejuni and C. coli by a standardized hippurate test and species-specific polymerase chain reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 27:513–8.